La PARR es una técnica molecular desarrollada recientemente en medicina veterinaria para el diagnóstico de neoplasia linfoide o de proceso reactivo: hagamos un balance de la situación con esta actualización de nuestros expertos.

El diagnóstico diferencial entre enfermedad linfoide reactiva y neoplásica en perros y gatos puede resultar complicado en algunos pacientes y, dado el diferente pronóstico y tratamiento, un diagnóstico correcto suele resultar crucial. La prueba de clonalidad (PARR) evalúa la variabilidad del reordenamiento genético de los receptores de antígenos de los linfocitos, puede ser una herramienta válida para integrar la interpretación citológica, histológica e inmunohistoquímica, cuando éstas no son concluyentes.

Intentemos aclarar el método y proporcionar una actualización en comparación con nuestra publicación anterior en este blog.

¿Qué es la técnica PARR?

Es una técnica de biología molecular (PCR) mediante la cual se analizan los reordenamientos genéticos de las células linfoides a nivel de las regiones VDJ de los genes de inmunoglobulinas (IG) de los linfocitos B y del receptor específico de los linfocitos T (T-Cell Receptor).

¿Qué es el reordenamiento de IG y TCR?

Los genes IG y TCR contienen varios segmentos de genes V, D y J que se reordenan aleatoriamente durante las fases iniciales del proceso de crecimiento y diferenciación de los linfocitos, confiriendo una gran variabilidad genética, con el fin de asegurar una alta capacidad por parte de los receptores de los linfocitos B y T de reconocer antígenos muy diferentes.

¿Por qué se llama PARR?

PARR es el acrónimo de “PCR for antigen receptor rearrangements”.

¿Sobre qué sustrato se realiza la PARR?

La prueba de clonalidad se realiza utilizando ADN genómico extraído de tejidos fijados con formalina e incluidos en parafina para su examen histológico. Además, se puede procesar a partir de preparaciones citológicas, incluidas las teñidas, y de efusiones cavitarias. El tejido fresco o congelado representa una matriz apropiada.

¿Pueden las diferentes matrices afectar al resultado final de la PARR?

Sí. El ADN genómico extraído de preparados citológicos y efusiones suele ser escaso y de baja calidad. Además, las células linfoides presentes en la muestra citológica pueden no ser representativas de toda la lesión, provocando un error de interpretación de la PARR (especialmente falsos negativos). En general, no se recomienda realizar la PARR en preparaciones citológicas y efusiones, especialmente sin inmunofenotipado. Las muestras enviadas para el examen histológico, normalmente más representativas de la lesión, son más adecuadas para este tipo de análisis.

¿CUál es la utilidad de la PARR?

En teoría, nos permite distinguir entre procesos reactivos/inflamatorios con componente linfocitario (policlonales) y procesos neoplásicos linfoides (monoclonales).

¿Es la PARR una prueba definitiva para el diagnóstico?

No, por definición los resultados PARR (perfiles de electroforesis) nunca son diagnósticos ni patognomónicos de un proceso específico y siempre deben interpretarse junto con datos clínicos, morfológicos (histología/citología) e inmunofenotípicos (citometría de flujo/inmunohistoquímica). Por lo tanto, las pruebas de clonalidad por sí solas no son definitivas.

¿Puedo utilizar la PARR para identificar el fenotipo de la neoplasia?

No, la PARR no debe considerarse como la técnica de diagnóstico principal para determinar el fenotipo (B o T). Otras herramientas, como la citometría de flujo, el examen inmunohistoquímico y el examen inmunocitoquímico son las pruebas indicadas para determinar el fenotipo de una neoplasia linfoide.

¿Cuándo solicito la PARR?

Puedo solicitar la PARR posteriormente a la recopilación adecuada de datos clínicos y procedentes de la anamnesis, toma(s) de muestra(s) para examen citológico e histológico y examen inmunohistoquímico. El laboratorio, que ya dispone de la muestra de tejido en parafina, podrá realizar la PARR tras la solicitud de una prueba adicional.

¿Qué resultados de PARR existen y cómo los interpreto?

Los perfiles de electroforesis se clasifican en diferentes categorías representadas por esquemas arquetípicos.(Figuras 1-4):

  • Clonal: suele ser indicativo de un proceso neoplásico. Se detecta un único producto de amplificación y de tamaños esperados.
  • Policlonal: generalmente indicativo de un proceso reactivo. Se detectan varios productos de amplificación de diferentes tamaños.
  • Pseudoclonal: puede estar asociado a un proceso reactivo o neoplásico. Se detecta un pico clonal no repetible en dos réplicas diferentes.
  • Ningún producto específico: puede estar asociado a un proceso reactivo o neoplásico. No se detectan productos de amplificación.

Figura 1: ejemplo de un amplificado monoclonal de dimensión esperada.

Figura 2: ejemplo de amplificado policlonal múltiple y de pequeña dimensión.

Figura 3: ejemplo de amplificados monoclonales no repetibles en dos amplificaciones diferentes (una de 137 pb y la otra de 115 pb).

Figura 4: ejemplo de amplificado negativo (no se observan productos de amplificación).

¿Existen límites?

Diversos aspectos técnicos y biológicos afectan la sensibilidad y especificidad de la PARR, dando lugar a resultados negativos, falsos positivos o la formación de productos pseudoclonales. Las siguientes imágenes esquemáticas enumeran las causas principales:

Falso Negativo:

debe sospecharse si los resultados de PARR entran en conflicto con los datos clínicos, morfológicos e inmunofenotípicos

 

 

●             Condición de cobertura inadecuada del primer que ocurre cuando el clon neoplásico utiliza genes no reconocidos por el primer.

●             Mutaciones a nivel de las secuencias de nucleótidos iniciales o terminales del gen: condición que se presenta cuando no se produce la amplificación debido a la ausencia de unión del primer.

●             Presencia de fondo policlonal: condición que ocurre cuando la lesión neoplásica se origina en un contexto de inflamación.

Falso Positivo:

revisión de picos monoclonales reproducibles en ausencia de neoplasia

 

 

Lesiones inflamatorias con expansión clonal provocadas por estímulo antigénico específico:

○             histiocitoma en regresión

○             pseudolinfoma y linfocitosis cutánea

○             hipersensibilidad a medicamentos

○             Infecciones por Ehrlichia y Leishmania

Reordenamientos canónicos: condiciones en las que los linfocitos presentan poco reordenamiento de la región VDJ.

Pseudoclonalidad:

identificación de un clon no reproducible después de la repetición de la prueba

 

Resultado no discriminante entre lesión inflamatoria o neoplásica:

○             muestra con un número bajo de células diana (neoplásicas)

○             tejidos u órganos con fondo linfocítico (bazo o ganglio linfático)

○             muestras paucicelulares: biopsias citológicas y endoscópicas

Dr. Michele Marino, responsable de biología molecular de MYLAV

Dr. Luca Aresu, responsable de patología de MYLAV

Dr. Walter Bertazzolo, Director Científico de MYLAV