La cytométrie en flux est une technique diagnostique avancée utile en cas de suspicion de néoplasie hématopoïétique, permettant de confirmer le diagnostic, de définir l’immunophénotype et de stadifier la néoplasie elle-même.

À ce jour, il n’est pas possible d’évaluer des néoplasies d’une autre origine, comme les carcinomes et les sarcomes.

La cytométrie en flux permet de déterminer la lignée d’origine et le stade de maturation des cellules hématopoïétiques présentes dans l’échantillon, grâce à l’utilisation d’anticorps monoclonaux qui identifient l’ensemble des protéines présentes sur chaque cellule (profil antigénique), caractéristique de chaque lignée cellulaire et variant selon le stade de maturation.

L’analyse de ces données permet presque toujours de distinguer les formes néoplasiques des formes réactives.

Quand ?

La réalisation de la cytométrie en flux est indiquée en cas de suspicion clinique de néoplasie hématopoïétique (ex. leucémies et lymphomes), si cette suspicion est corroborée par les résultats hématologiques, médullaires et cytologiques.

Ainsi, la cytométrie en flux ne doit pas être considérée comme une première étape diagnostique, mais plutôt comme un examen à réaliser uniquement en cas d’indication clinique ou cytologique.

Les données obtenues par cytométrie en flux doivent en effet être interprétées à la lumière du tableau clinique du patient et de l’aspect morphologique des cellules. Des profils cytofluorimétriques similaires peuvent avoir des significations différentes selon l’état clinique et les traitements précédents.

Comment ?

La cytométrie en flux s’effectue sur des cellules en suspension cellulaire, donc dans un milieu liquide.

Les échantillons tels que lesang, les épanchements ou la moelle osseuse peuvent être envoyés au laboratoire dans un tube avec EDTA.

Pour analyser des lésions solides (adénopathies, tumeurs, infiltrations spléniques, etc.), il est nécessaire de réaliser un prélèvement par aspiration à l’aiguille fine (FNA), comme en cytologie, et de remettre les cellules en suspension dans un milieu liquide.

À cet effet, il est possible d’utiliser du sérum (0,5-1 ml) du même patient, éventuellement dilué avec une solution physiologique si nécessaire, ou des milieux de culture cellulaire comme le RPMI. Ces précautions permettent de maintenir les cellules viables plus longtemps. Il est toutefois essentiel que l’échantillon soit envoyé au laboratoire dans les 24 heures suivant le prélèvement.

Il est déconseillé de remettre les cellules en suspension dans une solution physiologique sans ajout de sérum autologue, car cela entraînerait une dégénérescence rapide des cellules. Les cellules doivent être viables au moment de l’analyse, car toute dégénérescence, même partielle, peut compromettre la liaison des anticorps monoclonaux et fausser les résultats.

Enfin, il est important d’envoyer au laboratoire des lames de l’échantillon analysé, correctement préparées et fixées, afin de permettre une évaluation morphologique par cytologie.

Puisque l’analyse n’est réalisable que si le liquide contenant la suspension cellulaire présente une quantité suffisante de cellules nucléées (leucocytes normaux ou néoplasiques), il est recommandé de vérifier ce paramètre avant d’envoyer le tube au laboratoire, notamment lors de l’aspiration d’organes solides suivie du dépôt des cellules dans le milieu de transport. Pour ce faire, un comptage cellulaire peut être réalisé à l’aide d’un hémocytomètre standard (chambre de comptage) pour l’hématologie (si disponible dans la structure). L’envoi du tube au laboratoire ne doit être envisagé que si la suspension contient plus de 10 000 leucocytes. Dans le cas contraire, il est préférable de réaliser des ponctions supplémentaires (FNA) sur l’organe concerné afin d’augmenter la concentration cellulaire dans l’échantillon.

Enfin, il est essentiel de procéder à la cytologie et à la cytométrie en flux avant toute intervention thérapeutique (autant que possible en fonction des impératifs cliniques). En effet, les traitements par corticostéroïdes ou chimiothérapies provoquent la lyse des cellules lymphoïdes et, plus largement, des cellules néoplasiques, ce qui peut conduire à des échantillons non exploitables sur le plan diagnostique.

 

Figure 1. Procédure de prélèvement des lésions solides et préparation de l’échantillon destiné à la cytométrie en flux.

Pourquoi ?

Le principal avantage de la cytométrie en flux réside dans la nature du prélèvement (à l’aiguille fine), beaucoup moins invasif qu’une biopsie chirurgicale. Souvent, la cytologie suffit à orienter vers une néoplasie hématopoïétique/à cellules rondes. Cependant, dans certains cas, l’interprétation du tableau cytologique peut être complexe, et seuls des tests complémentaires comme la cytométrie en flux permettent de confirmer ou d’infirmer la présence d’une néoplasie.

Comparée aux autres techniques d’immunophénotypage (immunocytochimie ou immunohistochimie), la cytométrie en flux permet d’analyser un plus grand nombre de marqueurs sur les mêmes cellules et simultanément, offrant ainsi une meilleure classification des néoplasies. La cytométrie en flux permet d’obtenir un typage cellulaire dans des délais très courts (généralement en moins de 48 heures) et à coût réduit. Elle doit être utilisée pour confirmer et classifier les néoplasies hématopoïétiques.

Cependant, la cytométrie en flux ne permet pas d’évaluer la morphologie des cellules. Elle doit donc être précédée ou accompagnée d’un examen cytologique. De plus, dans certaines situations, l’évaluation de la distribution tissulaire des cellules néoplasiques est nécessaire, ce qui ne peut être réalisé que par un examen histologique.

Associée à la cytologie, la cytométrie en flux est essentielle pour classifier correctement une néoplasie hématopoïétique, permettant d’établir un pronostic précis et de définir la meilleure approche thérapeutique.

Exemples de classifications possibles :

  • Lymphomes à phénotype B
  • Lymphomes à phénotype T
  • Lymphomes T-zone (chien uniquement)
  • Hyperplasie lymphoïde réactive
  • Leucémies lymphoïdes chroniques B et T
  • Leucémies aiguës (lymphoïdes, myéloïdes ou indifférenciées)
  • Lymphocytose réactive

 

Figure 2. Examen cytologique, immunocytochimique (avec positivité pour le CD20) et cytométrique d’un cas de lymphome B à grandes cellules chez le chien. La population cellulaire est constituée presque exclusivement d’éléments lymphoïdes volumineux à phénotype CD45/CD21/MHC+ et négatifs pour le marqueur lymphoïde T (CD3).

La cytométrie en flux n’est pas utile pour analyser des leucocytoses causées par des cellules matures normales des lignées neutrophilique, éosinophilique et monocytaire, car elle n’apporte aucune information supplémentaire par rapport à ce qui peut être déjà évalué par un hémogramme standard.

Pour un diagnostic précis et une gestion clinique appropriée de chaque cas, il serait pertinent d’analyser systématiquement, par cytométrie en flux, la lésion primaire (comme un ganglion lymphatique hypertrophié), ainsi que le sang et la moelle osseuse. Cette approche permet également de réaliser une stadification de la pathologie, c’est-à-dire de quantifier l’infiltration des différents territoires, en enregistrant le pourcentage de cellules présentant des caractéristiques similaires à celles de la lésion principale.

La stadification des lymphomes au moment du diagnostic joue un rôle important tant sur le plan pronostique que thérapeutique, et permet aussi le suivi de la maladie après traitement.

Dans ce cadre, la cytométrie en flux peut être utilisée à la fin du protocole de chimiothérapie pour évaluer la maladie minimale résiduelle, c’est-à-dire quantifier, dans les différentes matrices (ganglion, sang, moelle osseuse, etc.), la proportion de cellules néoplasiques encore présentes. Cette évaluation est possible à condition de connaître le phénotype de la néoplasie avant le traitement. Elle revêt également un intérêt pronostique et thérapeutique, car les patients présentant une maladie résiduelle pourraient bénéficier d’un traitement supplémentaire en fonction du type de néoplasie.

En dehors des néoplasies hématopoïétiques, la cytométrie en flux peut aussi être utilisée pour le diagnostic de thymome chez le chien, comme illustré dans la figure suivante.

Figure 3 – Examen cytologique et cytométrie en flux d’une masse médiastinale chez le chien : une population de petits lymphocytes mélangés à des cellules épithéliales néoplasiques est observée. Cette population lymphocytaire montre le phénotype classique des thymocytes (lymphocytes T d’origine thymique), avec la double co-expression de CD4 et CD8, confirmant le diagnostic de thymome riche en lymphocytes.

 


Valeria Martini, Dr. vétérinaire, PhD, Experte MYLAV en Cytométrie en flux

Walter Bertazzolo, Dr. vétérinaire, Spécialiste européen EBVS en pathologie clinique vétérinaire (Dipl. ECVCP); Directeur scientifique de MYLAV