Vse pogosteje je govora o mikrobiomu in mikrobioti, tako v humani medicini kot tudi na našem veterinarskem področju; o čem je govora in kakšen možen razvoj lahko pričakujemo v prihodnosti?

O tem bomo spregovorili v novem blogu, ki je sad sodelovanja dveh strokovnjakov laboratorija Mylav: dr. Bottera in dr. Ruggiera.

Prebavni trakt je dom zapletenemu ekosistemu, sestavljenemu iz različnih skupnosti mikroorganizmov (bakterij, glivic, virusov, arhej in protozojev), imenovanem mikrobiota; z izrazom mikrobiom pa označujemo kompleksen sklop izražanja (ekspresije) genov teh mikroorganizmov.

Glavnino mikrobiote predstavljajo bakterije (približno 97-99 %), ki se delijo na fakultativne in obligatorne anaerobe in so razporejene po celotnem prebavnem traktu.

Prevladuje pet vrst bakterij (phyla): Firmicutes, Fusobacteria, Bacteroidetes, Proteobacteria in Actinobacteria (Honnefer 2017).

V želodcu pri psu je prisotnih le nekaj vrst bakterij, ki so odporne na kislo okolje; med njimi so Helicobacter in v manjši meri laktobacili; tanko črevo naseljujejo aerobne ali pogojno (fakultativno) anaerobne bakterije (Proteobacteri), medtem ko v debelem črevesu prevladujejo obligatorno anaerobne bakterije (Clostridia, Bacteroides, Fusobacterium).

Sestava mikrobioma slehernega posameznika je edinstvena in svojevrstna, čeprav obstajajo številne podobnosti med ljudmi in živalmi, ki živijo v podobnih epidemioloških razmerah.

Kljub tem filogenetskim razlikam so si končni metabolni produkti mikrobioma v prebavnem traktu posameznikov med seboj podobni. (Handl 2011).

. Taksonomska porazdelitev petih najbolj zastopanih debel v vzorcu blata pri psu (fotografija: dr. Michele Marino)
. Taksonomska porazdelitev petih najbolj zastopanih debel v vzorcu blata pri psu (fotografija: dr. Michele Marino)

Sodelovanje črevesne mikrobiote z njenim gostiteljem je dvosmerno, dinamično in spremenljivo v skladu z modelom vzajemne simbioze, tj. mutualizma, pri katerem imata obe komponenti (živalska in mikrobna) koristi v smislu dobrega počutja in preživetja. V vseh pogledih je to dejanski organ, ki je v interakciji predvsem, vendar ne izključno s prebavnim sistemom (Baquero 2012).

Veliko število genov, ugotovljenih v mikrobiomu (približno 3,3 milijona) predstavlja spremenljivo genetsko zasnovo psa ali človeka; zaradi njegove izjemne sposobnosti prilagajanja evolucijskim potrebam, ki se spreminjajo skozi čas, so ga poimenovali “adaptom“. Po mnenju številnih avtorjev je bil ta “adaptom” temeljnega pomena za evolucijo ljudi in živali in odigrava ključno vlogo v zapletenem svetu epigenetike.

Trenutno še vedno ni mogoče opredeliti, kdaj je mikrobiom “normalen”, saj ima vsak posameznik zelo individualen nabor mikroorganizmov, ki ga pridobi z rojstvom in ki se ohranja vse življenje in se spreminja zaradi fizioloških, parafizioloških in patoloških dogodkov, kot so staranje, spremembe v prehrani in bolezni. Kolonizacija na površinah sluznice in kože otroka se pojavi že ob rojstvu in se spreminja glede na način samega poroda (carski rez, naravni porod) in na okoljske dejavnike (dom, družina in hišne živali).

Pomembni prelomi v življenju so ključnega pomena tako za gostitelja kot za mikrobioto. Tako na primer pri odstavljanju pasjega mladiča postopen prehod z mlečne prehrane na trdno hrano spodbudi izrazit porast Bacteroidetes (od 1 % v dveh dneh do 39 % v dveh mesecih), ki razgrajujejo polisaharide, ter Fusobacteria, ki fermentirajo beljakovine in aminokisline in proizvajajo kratko verižne maščobne kisline (Small Chains Fatty Acids – SCFA).

Pestrost vrst mikroorganizmov (biotska raznovrstnost) v blatu pasjih mladičev se znatno poveča od starosti 2 dni do 52 tednov (Guard 2017), medtem ko so pri psih, starih od 3 mesecev do 12 let, opazili le malo ali nič sprememb v mikrobni raznolikosti (You 2021); to bi lahko podobno kot pri ljudeh nakazovalo, da se biotska raznovrstnost mikrobiote mladičev v poporodnem obdobju poveča, nekaj mesecev po odstavitvi stabilizira, nato pa pri naraščajoči starosti počasi upada.

Ta strnjen časovni prikaz poudarja pomen neonatalnega in mladostnega obdobja za oblikovanje mikrobioma, ki bo biotsko raznovrsten in kompleksen. Bazalna mikrobiota, ki se po mnenju številnih strokovnjakov oblikuje v prvih 4-6 mesecih življenja psa, se imenuje “jedrni” mikrobiom. Ravno v tej fazi lahko vse, kar pes izkusi, zaužije ali preboli, v veliki meri vpliva na to, kako zdrav ali občutljiv bo v prihodnosti.

Lastnikom, vzrediteljem in veterinarjem je treba pojasniti, kako pomembno je v tej fazi podpirati in obvarovati mikrobiom. Nasprotno pa gre pri upadu raznolikosti črevesne mikrobiote s staranjem za povsem fiziološki dogodek (Mizukami 2019).

Poudariti je treba tudi, da je vez med prehrano in mikrobioto osrednjega pomena skozi celoten življenjski ciklus. Tako je na primer mikrobiota ključna za vzpostavitev tako imenovane “oralne tolerance”, ki vpliva na bolnikovo dovzetnost na imunske motnje, kot so atopija ali kronične vnetne enteropatije.

Kot vsak drug organ ima tudi mikrobiota številne in zelo raznolike vloge in funkcije ter interakcije na številnih področjih: presnovno (npr. pretvorba žolčnih kislin), obrambno (npr. premagovanje in odpornost na patogene, kar predstavlja ključno sestavino naravne črevesne pregrade), trofično (npr. sinteza vitaminov B in K, proizvodnja SCFA), imunološko (npr. oralna toleranca) in nevroendokrino (npr. GABA, uravnavanje črevesne peristaltike in izločanja).

Za kakovostno oceno mikrobiote je treba poznati koncept evbioze in disbioze.

Z evbiozo je mišljeno kakovostno in količinsko ugodno ravnovesje sestavin mikrobioma, ki omogoča pozitivno presnovno in imunološko sodelovanje z gostiteljem, izboljšuje delovanje prebavnega trakta, optimizira vnos hranil, uravnava imunsko odzivnost ter vnetne procese v črevesju in sistemu nasploh.

Disbioza pa pomeni strukturno spremembo mikrobioma, tako v smislu sestave kot tudi delovanja (presežek patobiontov, zmanjšanje ali celotna izguba “dobrih” komenzalnih bakterij, selektivna izguba nekaterih specifičnih sevov, sprememba profila mikrobiote, pritrjene na sluznico itd.).

Pomembno je poudariti, da ti pojmi nimajo ostro začrtanih in prekrivajočih se meja med posamezniki, ki pripadajo različnim vrstam in/ali različnimi posamezniki iste vrste. Prag sprememb, po katerem lahko govorimo o disbiozi, se spreminja, prav tako pa še ni nedvoumno dogovorjeno, kateri je idealen, torej evbiotičen nabor bakterij, na podlagi katerega bi lahko opredelili tudi njegove spremembe.

Nagnjenost k razvoju črevesne disbioze je odvisna od značilnosti in stabilnosti “jedrnega mikrobioma”, pri čemer je treba poudariti, da ima slednji veliko sposobnost obnavljanja svoje prvotne sestave (t.i. rezilienca) po tem, ko je bil izpostavljen motečemu dogodku.

Kako lahko torej opišemo in ocenimo stanje mikrobioma? Medtem ko so za večino trebušnih organov na voljo klinično-patološke analize in metode posredne slikovne diagnostike, se pri analizi mikrobioma zanašamo na tako imenovane “omične znanosti” (metagenomika, metabolomika, proteomika in transkriptomika), ki temeljijo na načelih napredne bioinformatike in kompleksnih analitičnih orodjih, ki so bili še pred nekaj leti nedostopna.

Metagenomska analiza temelji na preučevanju niza zaporedij DNK iz različnih mikroorganizmov.

Tehnologija sekvenciranja naslednje generacije omogoča identifikacijo črevesnih mikrobioloških skupnosti z analizo variabilnih regij V2-V4-V8 e V3-V6/7-V9 gena, ki kodira RNA 16S; ker je prisoten v vsaki bakteriji, ga je namreč mogoče uporabiti kot merilo za razvrščanje. Seveda pa lahko na rezultate vpliva več predanalitičnih dejavnikov (zbiranje matric, ekstrakcija RNA, primerji, uporabljena tehnologija). Če povzamemo, za sekvenciranje gena 16S rRNA mikrobioma ne obstaja en sam, najboljši pristop, vendar bi lahko razumevanje nekaterih njegovih omejitev, doslednost metod analize in uporaba dopolnilnih tehnik (NGS, qPCR, metabolomika) pomagali odpraviti vsaj nekatere od številnih dvomov.

Zaradi številnih in raznovrstnih vlog, ki jih ima črevesni mikrobiom pri fizioloških in patoloških stanjih, pomen njegove analize ni zgolj špekulativne narave, temveč predstavlja dejansko razsežnost s terapevtskega vidika.

Tako imenovana “modulacija mikrobiote” se v praksi že uveljavlja, čeprav na nekoliko okoren in empiričen način, z uporabo probiotikov, prebiotikov, simbiotikov, antibiotikov in fekalne transplantacije.

Farmacevtska industrija že vrsto let uvršča t.i. “bioprotiko” in modulacijo mikrobioma v ospredje svojih raziskav, katerih cilj je opredeliti terapevtska orodja, ki lahko popravijo specifične vzorce disbioze, povezane z različnimi vrstami bolnikov in bolezni. Po vsej verjetnosti smo na pragu nove dobe v zdravljenju gastroenteroloških bolnikov.

Literatura:

Jan Suchodolski, Jennifer Camacho, Jörg M. Steiner, Analysis of bacterial diversity in the canine duodenum, jejunum, ileum, and colon by comparative 16S rRNA gene analysis, FEMS Microbiology Ecology, Volume 66, Issue 3, December 2008

Honneffer, J.B., Steiner, J.M., Lidbury, J.A. et al. Variation of the microbiota and metabolome along the canine gastrointestinal tract. Metabolomics 13, 26 2017.

Guard BC, Mila H, Steiner JM, Mariani C, Suchodolski JS, Chastant-Maillard S. Characterization of the fecal microbiome during neonatal and early pediatric development in puppies. PLoS ONE. (2017)

You I., Kim M.J. Comparison of Gut Microbiota of 96 Healthy Dogs by Individual Traits: Breed, Age, and Body Condition Score. Animals 2021, 11, 2432.

Mizukami K, Uchiyama J, Igarashi H, Murakami H, Osumi T, Shima A, et al. Age-related analysis of the gut microbiome in a purebred dog colony. FEMS Microbiol Lett. (2019)

Pilla R., Suchodolsky J.S. The Gut Microbiome of Dogs and Cats, and the Influence of Diet Vet Clin Small Anim 51 (2021) 605-621

Garrigues Q, Apper E, Chastant S and Mila H (2022) Gut microbiota development in the growing dog: A dynamic process influenced by maternal, environmental and host factors. Front. vet. Sci. 9:964649.

Pilla R and Suchodolski JS (2020) The Role of the Canine Gut Microbiome and Metabolome in Health and Gastrointestinal Disease. Front. vet. Sci. 6:498

Kalenyak K, Isaiah A, Heilmann RM, Suchodolski JS, Burgener IA. Comparison of the intestinal mucosal microbiota in dogs diagnosed with idiopathic inflammatory bowel disease and dogs with food-responsive diarrhea before and after treatment. FEMS Microbiol Ecol. (2018)

Enrico Bottero, dr. vet., strokovnjak za gastroenterologijo Mylav
Pietro Ruggiero, dr. vet., strokovnjak za gastroenterologijo Mylav
Michele Marino, mol. biol., odgovoren za oddelek molekularne biologije in genetike Mylav
Walter Bertazzolo, dr. vet. EBVS – Evropski specialist za veterinarsko klinično patologijo (dipl. ECVCP); Znanstveni direktor MYLAV