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La lettura di un campione citopatologico rappresenta l'ultimo di una serie di steps che includono: la scelta della lesione, il metodo di campionamento e il corretto allestimento del vetrino. Ogni errore commesso in uno qualsiasi di questi passaggi può inficiarne  l’interpretazione. In questo blog, il dr. Francesco Albanese, consulente del Laboratorio LaVallonea e responsabile del servizio di Dermatologia, con l'ausilio di filmati esplicativi, descriverà le metodiche di prelievo da eseguire per la raccolta di cellule da lesioni cutanee.

Tecniche di campionamento e preparazione del vetrino

Le tecniche di prelievo per i campioni provenienti da lesioni cutanee si differiscono in base al tipo di lesione. Le principali metodiche di cui ci si avvale comprendono: a) l’apposizione, b) il raschiato e c) la biopsia con ago sottile, con o senza aspirazione

 

1) Apposizione

La tecnica di apposizione è impiegata per campionare cellule da lesioni superficiali quali erosioni, papule e pustole. In caso di lesioni essudative o ricoperte da materiale grasso è sufficiente apporre delicatamente il vetrino sulla lesione affinché le cellule aderiscano alla sua superficie. La stessa metodica si utilizza per campionare cellule dalla sommità di una papula ma solo dopo aver delicatamente spremuto la stessa tra le dita.

 

 

 

 

Per campionare cellule da pustole integre, si esegue il “calco di Tzanck: con un ago sottile si rompe la pustola alla base, si sollevano i corneociti che ne compongono il "tetto" e si raccoglie il pus apponendo un vetrino sull’essudato esposto (Video1).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

In presenza di pustole di piccole dimensioni, risulta difficile eseguire il prelievo mediante calco di Tzanck, pertanto è consigliabile rompere la pustola esercitando con il margine di un vetrino una leggera pressione laterale che consenirà al pus di depositarsi su di esso  (Video 2).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Il materiale raccolto viene poi delicatamente strisciato mediante l'utilizzo di un secondo vetrino. I due vetrini verranno fatti scivolare l'uno sull'altro con un movimento costante ma in direzione opposta (Video 3).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Le pustole si disidratano rapidamente, si rompono e formano i cosiddetti “collaretti epidermici”, caratteristiche lesioni circolari con un’area centrale alopecica e talvolta iperpigmentata, delimitate da un bordo eritematoso coperto da detrito crostoso. Per campionare cellule dal collaretto epidermico è necessario sollevare le croste presenti ai bordi (Video 4).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

La tecnica per impronta è inoltre utilizzata per prelevare cellule dalla superficie inferiore delle croste. La procedura è molto semplice: una volta che la crosta viene rimossa, è sufficiente appoggiare la sua superficie inferiore su un vetrino oppure è possibile apporre quest’ultimo direttamente sulla cute esposta dopo la rimozione della crosta (Video 5).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Nel caso di lesioni essudative rilevate (es. placche), l’apposizione potrebbe condurre a un’errata interpretazione se prelevassimo cellule solo con questa metodica, poiché tutte le lesioni cutanee sono esposte alla contaminazione batterica orale e ambientale; pertanto quando dobbiamo prelevare cellule da placche e noduli erosi o ulcerati, la biopsia con ago sottile resta comunque la tecnica d’elezione.

Nelle lesioni desquamative “secche”, in cui l’apposizione del vetrino non consentirebbe alle cellule di aderire, è possibile raccogliere del materiale usando del nastro adesivo trasparente. Questa tecnica, comunemente definita “Scotch® test”, è anche il miglior metodo per prelevare cellule da lesioni interdigitali o da pieghe cutanee, sulle quali non è possibile posizionare direttamente il vetrino.

Essa consiste nel far aderire il lato adesivo di un pezzo di nastro trasparente sopra la lesione; le cellule presenti sulla cute rimangono così attaccate al collante (Video 6).

 

 

Prelievi citologici mediante raschiato

 

Il raschiato superficiale è una tecnica traumatica utilizzata per prelevare una grande quantità di cellule da lesioni ulcerate. Il numero di cellule raccolte è solitamente maggiore rispetto a quello ottenuto mediante apposizione, anche se i campioni sono inevitabilmente maggiormente emocontaminati e le cellule possono più facilmente subire danneggiamenti.

 

 

 

 

Il raschiato può essere eseguito servendosi di una lama da bisturi o di un vetrino portaoggetto. Il materiale presente sulla superficie della lesione è solitamente ricco di detriti necrotici, sangue e, di conseguenza, raramente diagnostico; è pertanto consigliabile rimuovere il materiale più superfciale con un primo raschiato e di campionare quello subito al di sotto mediante una seconda delicatissima scarificazione. Il materiale ottenuto viene poi delicatamente strisciato su un secondo vetrino avendo cura di non applicare un’eccessiva pressione che potrebbe danneggiare la morfologia delle cellule (Video 7).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

La tecnica di scarificazione può essere impiegata anche per campionare cellule direttamente da una cute con scaglie grasse o dalle pieghe ungueali (Video 8).

 

 

 

 

 

 

 

 

Prelievi citologici mediante Agoinfissione  o Agoaspirazione

 

L’agoinfissione, con o senza aspirazione, è la tecnica più utilizzata in citologia veterinaria ed è l'unica eseguibile quando vogliono essere campionate cellule da noduli, placche o comunque lesioni rilevate.  

 

L’agoinfissione non richiede manovre di aspirazione forzata come l'agoaspirazione; è la tecnica che l'autore preferisce usare per campionare qualsiasi tipo di neoformazione cutanea ed è molto utile quando i noduli sono localizzati in aree particolarmente delicate, dolorose o a rischio, come le palpebre e le giunzioni muco-cutanee. Nei campioni che cedono uno scarso numero di cellule con la sola infissione, è possibile eseguire un prelievo mediante aspirazione.

 

 

 

 

 

Per eseguire un'agoinfissione, è necessario inserire l’ago nel nodulo ed eseguire ripetuti movimenti avanti e indietro e di rotazione, in più punti della lesione. Questi movimenti permettono alle cellule di penetrare all’interno dell’ago. Tale metodica riduce il “trauma” cellulare rispetto all'aspirazione forzata e, nella maggior parte dei casi, ci permette di prelevare campioni di ottima cellularità. Il materiale raccolto non deve essere “spruzzato” energicamente sul vetrino, ma delicatamente depositato su di esso per essere poi strisciato, con un secondo vetrino, che si fa scorrere sul primo ma in direzione opposta (Video 9).

 

 

 

 

 

La pressione da esercitare sui vetrini dipende dalla consistenza del materiale raccolto e solo con l’esperienza l'operatore acquisirà le manualità appropriate al fine di ottenere campioni di ottima qualità. I due parametri che consentono di valutare uno striscio di buona qualità sono l'integrità delle cellule e la loro disposizione in un singolo strato, fondamentale ai fini di un’ottimale colorazione. Nel caso in cui venga prelevato molto materiale, si raccomanda di utilizzarlo per allestire più vetrini, alcuni dei quali possono essere conservati "in bianco" per eventuali colorazioni speciali.

 

Colorazione del vetrino 

La colorazione più comunemente utilizzata nella pratica ambulatoriale è quella tipo Romanowsky, di norma impiegata per colorare gli strisci di sangue (Hemacolor®, Diff Quick®). E’ una colorazione rapida, pancromatica che permette di ottenere degli ottimi dettagli citoplasmatici e di visualizzare la maggior parte dei microrganismi, anche se alcuni dettagli nucleari potrebbero andare persi. Come già accennato in precedenza, per avvalersi di queste colorazioni, dobbiamo allestire vetrini con cellule disposte in monostrato affinché il colorante le possa completamente colorare. Questa colorazione ha il grande vantaggio di essere velocemente eseguita: sono necessari solo pochi secondi.

I kit di colorazioni rapide in commercio sono costituiti da tre soluzioni: un fissativo su base alcolica, un primo colorante con affinità per substrati acidofili (rosso) e un secondo per quelli basofili (blu). La colorazione si esegue mediante immersione ed estrazione in rapida sequenza e per pochi secondi, del vetrino nelle tre soluzioni. Non vi è un numero stabilito di immersioni da effettuare, ma se ne raccomandano almeno tre o quattro per ogni colorante.

Il materiale raccolto con nastro adesivo trasparente può essere invece colorato in diversi modi. Se il nastro adesivo è di buona qualità, può essere colorato come un vetrino, ma la maggior parte dei nastri adesivi hanno la tendenza, una volta immersi nel fissativo, ad arricciarsi od opacizzarsi. Per ovviare a questo inconveniente si può immergere il nastro direttamente nei coloranti, evitando il passaggio nella soluzione alcolica. Un'ulteriore variante, che risulta più rapida e altrettanto valida, ed è quella comunemente utilizzata dall’autore, prevede che lo scotch, con la parte adesiva su cui sono adese le cellule, sia direttamente collocato su un vetrino portaoggetto su cui sono state precedentemente poste alcune gocce del colorante blu del kit o del blu di lattofenolo o cristalvioletto.  Prima di osservare il vetrino al microscopio, è però fondamentale rimuovere l'eccesso di colorante comprimendo delicatamente sulla superficie dello scotch, un pezzo di carta assorbente  (Video 10-11).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



  • Creato il: 2015-10-15 - 15:37:31
  • Postato da: Francesco Albanese
  • Categoria: Citologia

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In presenza di una formazione mediastinica occupante spazio, la diagnostica per immagini associata alla biopsia cito-istologica rappresentano le armi essenziali per arrivare ad una diagnosi corretta. 

Figura 1: radiografia laterale in un gatto con timoma.

I prelievi citologici in questo caso sono di facile esecuzione e non richiedono particolare esperienza, ma quanto è efficiente la citologia per la diagnosi? In un recente studio a cui hanno partecipato i citologi del laboratorio LaVallonea, Enrico Bottero e Walter Bertazzolo, la concordanza tra l’esame citologico e la diagnosi definitiva istologica si rivelava da buona ad ottima. 

Figura 2: linfoma mediastinico in un giovane cane.

Questi ottimi risultati erano in parte dovuti alla elevata prevalenza di neoplasie linfoidi nella casistica presa in esame, notoriamente facili da diagnosticare mediante citologia. I possibili errori diagnostici, seppur infrequenti, erano legati alla corretta classificazione delle neoplasie epiteliali (es. timoma vs carcinomi) rispetto a quelli neuro-endocrini (es. chemodectoma vs neoplasie della tiroide ectopica) o mesoteliali.

Figura 3: neoplasia neuro-endocrina (chemodectoma) in un cane.

 

Per chi volesse saperne di più ecco il riferimenti bibliografico dello studio sopra citato:

L. Pintore, W. Bertazzolo, U. Bonfanti, M. E. Gelain and E. Bottero

Cytological and histological correlation in diagnosing feline and canine mediastinal masses.

Journal of Small Animal Practice



  • Creato il: 2015-09-27 - 17:48:57
  • Postato da: Walter Bertazzolo
  • Categoria: Citologia

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immagine COME OTTIMIZZARE LA PREPARAZIONE DEI CAMPIONI CITOLOGICI: INTERVISTA A WALTER BERTAZZOLO

L’esame citologico è una metodica diagnostica molto comune in medicina veterinaria: rapida, facile da eseguire e a basso costo. Essa può fornire informazioni diagnostiche in numerose discipline cliniche (dermatologia, oncologia, medicina interna, ecc.).

Il citologo, chiamato ad affiancare il clinico nella soluzione del caso diagnostico, si trova ad operare dovendo interpretare i preparati in un mondo di luci e di colori che magicamente prendono forma agli occhi esperti di che legge.

Uno degli aspetti più frustranti sia per il citologo che per il veterinario che ha riferito il caso è l'ottenere risultati non diagnostici, in particolar modo quando il materiale inviato sia di cattiva qualità o non rappresentativo della lesione campionata, a causa di un’errata scelta ed esecuzione della metodica di campionamento. Tutto ciò si traduce in frustrazione anche da parte del cliente che ha pagato il test senza avere ottenuto indicazioni utili per la gestione del problema che affligge il proprio animale.

Allo scopo di ottimizzare il prelievo citologico ci sono alcune regole da segire e consigli che, quando osservati, possono ridurre drasticamente la percentuale di campioni “acellulari o non conclusivi”. 

In questa intervista, il Dr. Walter Bertazzolo, direttore scientifico del Laboratorio LaVallonea, ci suggerisce 10 regole per un buon campionamento citologico.

Ciao Walter, per cominciare qual è la regola più importante in citologia diagnostica?

Regola N° 1: il clinico è più importante del citologo.

Ai fini di un buon risultato, chi esegue il campionamento è molto più importante di chi lo esamina al microscopio! Un prelievo di cattiva qualità sarà, infatti, sempre non conclusivo, anche se inviato al citopatologo più in bravo del mondo.

Ok ma mettiamo il caso che io sia un clinico e debba decidere se fare o meno un prelievo citologico da una neoformazione o da un organo, come faccio a capire se ne valga la pena o se sia più indicato fare un esame istologico?

Regola N° 2: cerchiamo di usare la logica e la testa prima di procedere con le mani.

In presenza di neoformazioni è sempre consigliabile eseguire inizialmente un prelievo citologico perché meno invasivo, poco costoso e con tempi di risposta più rapidi. In molte patologie d’organo, tuttavia, la citologia può essere poco indicativa e, per ottenere la diagnosi, si rende necessaria una biopsia istologica. Ne sono un esempio, i prelievi citologici effettuati da fegato e reni in soggetti con sospetta epatopatia e/o nefropatia, che molto spesso non forniscono informazioni utili al clinico. In caso di dubbio è consigliabile chiedere una consulenza al laboratorio prima di avventurarsi in procedure che possono risultare poco utili, invasive e dai risultati incerti.

I campionamenti citologici possono venire effettuati mediante diverse tecniche (FNA/Ago-infissione, apposizione, brushing ecc.). Quale di queste è da preferirsi?

Regola N° 3: non esiste il metodo di prelievo infallibile e perfetto.

Anche in questo caso non può esserci una risposta univoca perché dipende da cosa dobbiamo campionare. Ogni volta che si deve analizzare una neoformazione nodulare o un organo che “cede” facilmente cellule (es. linfonodo, fegato, tessuto ghiandolare, ecc.), sicuramente i campionamenti con ago fine sono da preferirsi. L’apposizione è da riservarsi a lesioni ulcerate o su superfici di taglio di un tessuto da analizzare, avendo cura di eliminare l’eccesso di sangue e di detriti superficiali, inutili ai fini diagnostici. Il brushing e il raschiato sono da evitare quasi sempre, in quanto raccolgono solo materiale superficiale per cui possono essere utili quando si deve analizzare la parte superficiale di una mucosa (per esempio nasale). Sui preparati bioptici endoscopici, infine, è consigliabile eseguire lo squash-prep, ovvero lo schiacciamento vigoroso di un frammento tissutale tra due vetrini portaoggetto.

Bene, facciamo finta che io abbia deciso di effettuare un campionamento citologico e stia raccogliendo il materiale da un tessuto. Cosa dovrei fare per allestire uno striscio qualitativamente valido?

Regola 4: ottieni sempre un “monostrato” di cellule.

Per poter analizzare le cellule, queste devono essere disposte sul vetrino in uno strato sottile (monostrato), dal momento che le colorazioni rapide tipo Romanowsky utilizzate in ambulatorio necessitano di un sottile strato di cellule per consentire ai coloranti di penetrarle. Ciò si ottiene strisciando delicatamente il materiale prelevato tra due vetrini portaoggetto, sfruttando la pressione esercitata dai due vetrini e avendo cura di non esercitare una forza eccessiva che causerebbe il danneggiamento delle cellule e, di conseguenza, inficerebbe la lettura del preparato.

E dopo lo striscio, cosa faccio con il vetrino?

Regola 5: fissa immediatamente il campione.

Questo passaggio è il più trascurato in genere dai clinici, ma è forse il più importante. Per poter consentire una corretta colorazione del vetrino le cellule, una volta strisciate, devono essere asciugate all’aria, per esempio scuotendo il vetrino rapidamente. Non vanno mai utilizzati, invece (tranne rari casi eccezionali e per colorazioni particolari come la Papanicolau o l’ematossilina-eosina), i fissativi chimici spray.

Il processo di rapida fissazione all’aria è particolarmente importante per i campioni citologici composti da liquidi o con molto sangue (es. liquido sinoviale, versamenti, midollo osseo, ecc.), per i quali una asciugatura troppo lenta è causa quasi certa di insuccesso. In questi casi è utile utilizzare una fonte di calore (es. Asciugacapelli) per fissare rapidamente il campione. Asciugate sempre bene i campioni prima di porli nei contenitori portavetrini da inviare al laboratorio.

Perfetto, a questo punto il campione deve essere analizzato subito o può essere conservato? Inoltre, che accorgimenti devo avere per la spedizione dei vetrini in laboratorio?

Regola 6: i preparati ciotologici sono resistenti, ma non a tutto!

Se conservati in luogo asciutto e lontano dalla polvere, gli strisci possono venire conservati per parecchi giorni, se non per diverse settimane. Sono però da evitare alcuni errori comuni: prima della colorazione definitiva bisogna evitare di bagnare i vetrini, dal momento che le cellule verrebbero asportate dal vetrino; un aspetto molto trascurato, e causa di frequenti campioni “non interpretabili”, è quello di utilizzare vetrini conservati in ambulatorio in prossimita della formalina o, evenienza più comune, di inviare al laboratorio, nello stesso pacco, i campioni citologici e quelli istologici. La formalina è una sostanza molto volatile e, anche se i barattoli sono chiusi ermeticamente, i suoi vapori fuoriescono e, una volta venuti a contatto con le cellule o con i vetrini nuovi, non consentono ai coloranti di penetrare in maniera ottimale, rendendo pertanto i campioni non interpretabili.

Ma quanti campionamenti devo eseguire per avere più possibilità di ottenere un preparato diagnostico?.

Regola 7: più campioni fai, più è probabile ottenere una diagnosi.

E’ ovvio che in questo caso bisogna mettere in conto molte altre variabili: la compliance del paziente, la dolorosità della sede di prelievo, il rischio di complicanze in caso di punzioni multiple, ecc. E’ comunque consigliabile inviare tutti i vetrini allestiti, anche quelli che macroscopicamente sembrano poco cellulari.

Devo sempre inviare tutto il materiale non colorato o posso iniziare a controllare già in ambulatorio i risultati del mio campionamento?

Regola 8. Impara dai tuoi errori (o da quegli degli altri).

Per evitare di inviare campioni non diagnostici, potrebbe essere conveniente colorare uno o più vetrini e valutare se è presente o meno del materiale significativo e, in caso ci fossero cellule, procedere a sottoporre i campioni al laboratorio. Qualora i campioni fossero acellulari, si può provare a ricampionare la lesione o a valutare la possibilità di eseguire un esame istopatologico.

Con un minimo di esperienza al microscopio, e senza necessariamente essere dei citologi esperti, questo procedimento aiuta a migliorarci e a capire sia quando un campione non è cellulare o rappresentativo della lesione sia qual è il motivo dell’insuccesso. E’ opportuno inviare anche i vetrini che sono stati colorati come “controllo di adeguatezza”  onde evitare di rischiare che l’unico vetrino diagnostico sia quello da te controllato.

E nel caso in cui la mia percentuale di insuccessi fosse comunque troppo alta, cosa potrei fare per migliorare la mia tecnica di prelievo?

Regola 9: confrontati sempre con colleghi più esperti di te.

Non avere timore di chiamare i colleghi consulenti del laboratorio LaVallonea, che sapranno darti consigli utili, caso per caso.

E se anche con tutti questi accorgimenti non riuscissi ad ottenere materiale adeguato? 

Regola 10. Ti resta sempre la biopsia istologica.

Nel caso in cui la citologia non fosse diagnostica, non fosse effettuabile o inutile in quel caso specifico, ci resta sempre la possibilità di ricorrere al campionamento istologico, che rappresenta, sempre, il “gold standard”.

Grazie Walter per i tuoi preziosi consigli!



  • Creato il: 2015-02-19 - 10:10:40
  • Postato da: Guglielmo Giordano
  • Categoria: Citologia

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